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　酶聯(lián)免疫技術(shù)的特點

酶聯(lián)免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學反應(yīng)檢測敏感性的一種標記免疫技術(shù)。該技術(shù)所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。

　　一、酶和酶作用的底物

　　1.辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，

　　在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP對受氫體的專一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H202方便。

　　許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS.OPD為在ELISA中應(yīng)用zui多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無此缺點。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計中定量；因此應(yīng)用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。

　　2.堿性磷酸酶（AP）：是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般采用對硝基苯磷酸酯（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時間。

　　在ELISA中應(yīng)用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結(jié)合物時得率較HRP低等原因，國內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮，可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶。

　　二、酶標記抗體或抗原

　　酶標記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）。抗原由于化學結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合，如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。醫(yī) 學教育網(wǎng)原創(chuàng)

　　1.戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復性好。缺點是交聯(lián)時分子間的比例不嚴格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法l0倍左右。

　　2.過碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成按摩爾比例結(jié)合的酶標結(jié)合物。有人認為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法。但也有只認為由于所用試劑較為劇烈，各批實驗結(jié)果不易重復。

　　按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。

　　3.標記抗體鑒定：通常采用棋盤滴定法進行篩選，見第十九章。

　　三、固相載體

　　酶免疫技術(shù)的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體和與標記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。可作固相載體的物質(zhì)很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式，在測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學反應(yīng)，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。

　　聚苯乙烯載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點是還能兼作反應(yīng)的容器，zui后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量反應(yīng)板，于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，通用的標準板形是8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)或l2聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。

　　良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng／ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10%.與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。

　　為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和一個典型的陰性標本。將它們分別進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較測定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別zui大，這種載體就是這一ELISA測定的zui合適的固相載體。

　　除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在本章“膜載體的酶免疫測定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。

　　四、免疫吸附劑

　　固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。