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抗體或抗原可以吸附在合適的載體上,酶標(biāo)記抗體或抗原相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標(biāo)記的抗原抗體免疫復(fù)合物,在一定的底物參與下,復(fù)合物上的酶催化底物使其水解,氧化或還原成為另一種帶色物質(zhì)。由于在一定的條件下,酶的降解底物和呈現(xiàn)色澤是成正比的,因此可以應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定,從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的含量。這就是Peter Perlmann 和Eva Engvall所建立的ELISA技術(shù)的原理。
按照所用固相載體的不同,ELISA又分為普通ELISA和Dot-ELISA.
招照抗體或抗原在固相載體上不同的吸附方法,又根據(jù)使用不同的抗體例如能與抗原直接反應(yīng)的抗體(通常稱為一抗),能與一抗起免疫結(jié)合反應(yīng)的標(biāo)有酶的抗體(通常稱為酶標(biāo)二抗),ELISA分化出多項(xiàng)不同的測(cè)定方法。
ELISA一般分為下述幾種類型:
(1) 直接法:首先將抗原吸附于載體表面,然后將酶標(biāo)記抗體與該抗原反應(yīng)結(jié)合,形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物,zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì),進(jìn)行光密度測(cè)定,算出抗原存在量。
(2) 間接法:首先將抗原吸附于載體表面,然后加抗血清,使特異性抗體(*抗體)與抗原結(jié)合,再加酶標(biāo)記抗球蛋白(第二抗體,即抗*抗體的抗體),與*抗體結(jié)合,形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物,zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì),進(jìn)行光密度測(cè)定,算出抗體存在量。
(3) 雙重抗體法:首先將抗體吸附于載體表面,形成抗體球蛋白致敏載體表面,然后加抗原溶液,使抗原與抗體結(jié)合,再加入酶標(biāo)記的抗體球蛋白,與被致敏載體表面吸附的抗原結(jié)合,形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物,zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì),進(jìn)行光密度測(cè)定,算出抗原存在量。ELISA雙重抗體法也稱ELISA雙重抗體夾心法,該法能減弱非特異顏色的干擾,并且在測(cè)定時(shí)可不做空白對(duì)照。
(4) 酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法:首先將抗體吸附于載體表面,形成抗體球蛋白的致敏載體表面,然后加入以不同比例混合的抗原和酶標(biāo)記的抗原溶液,與吸附在載體上的抗體發(fā)生免疫反應(yīng),形成酶標(biāo)記抗原與抗體的免疫復(fù)合物和非標(biāo)記抗原與抗體的免疫復(fù)合物,zui后加入底物,通過酶的底物水解量(測(cè)定光密度而知)來確定未知溶液有無抗原及抗原量多少。
酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法利用混合的未標(biāo)記抗原和酶標(biāo)記抗原相互競(jìng)爭(zhēng)抗體上的結(jié)合點(diǎn),從而進(jìn)行抗原的定量。未標(biāo)記抗原的量越大,則酶標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制。但是競(jìng)爭(zhēng)法在實(shí)驗(yàn)時(shí)比較復(fù)雜,有時(shí)在抗原混合液與相應(yīng)抗體孵育后,在測(cè)定游離抗原與抗體相結(jié)合抗原的活性以前,要先進(jìn)行鹽析或有機(jī)溶劑沉淀或第二抗體沉淀等方法把兩種不同存在形態(tài)的抗原分開。并且在加入底物后,容易產(chǎn)生血清色的物質(zhì)。因此,每次測(cè)定時(shí)都需做空白對(duì)照。由于這些缺點(diǎn),酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法使用不多。