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單核細(xì)胞增生李斯特菌核酸檢測試劑盒 (PCR法)

【產(chǎn)品概述】

李氏桿菌病是由單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的一種急性或慢性傳染病。本病可分為子宮炎型、敗血型和腦炎型。在家畜中，綿羊的李氏桿菌病最為常見，并幾乎全為腦炎型，各種年齡和性別的綿羊都可患?。粩⊙烷g或發(fā)生于10日齡以下的羔羊；子宮炎型多發(fā)生于懷孕最后兩個月的頭胎綿羊。山羊的病型與綿羊的相同。

本試劑盒應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，可快速、準(zhǔn)確地定性檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA，適用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【檢測原理】

 以提取的待檢樣本的DNA為模板，在PCR反應(yīng)體系中，低溫條件下引物與互補(bǔ)的模板形成雙鏈，72℃時在Taq DNA 聚合酶作用下，以dNTP 為原料，以引物為復(fù)制的起點，沿模板合成一條新鏈。每個循環(huán)包括：高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個過程。每一次循環(huán)使擴(kuò)增的DNA 片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35 次循環(huán)，使擴(kuò)增的DNA 片段放大了數(shù)百萬倍以上。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)核酸染料染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA 片段的擴(kuò)增帶。

【試劑盒組成】

* 質(zhì)控品說明：陰性質(zhì)控品用于對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，陽性質(zhì)控品用于對檢測試劑進(jìn)行監(jiān)控。

【自備物品】

1.   儀器：分析天平、離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器等；

試劑：DNA提取試劑、核酸染料(如EB、GoldView II)、DNA Marker(如TaKaRa 1.   DL2000)、Loading Buffer、1×TAE(電泳緩沖液)、瓊脂糖、雙蒸水等；

2.   耗材：稱量紙、吸頭、量筒、500ml錐形瓶等。

【使用方法】

注：所有試劑使用前須*解凍，混合均勻后于5,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）

待檢樣本的核酸提取可采用核酸提取試劑盒，具體提取方法請參照相應(yīng)說明書；陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品無需提取，已包裝在試劑盒內(nèi)，可直接使用。

2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（配液區(qū)）

取N個（N=陰性質(zhì)控品+待檢樣本+陽性質(zhì)控品）PCR反應(yīng)管，每管分別加入PCR反應(yīng)液19.6μl、PCR酶0.4μl (也可按照每頭份用量，計算N+1頭份PCR反應(yīng)液、PCR酶各自所需總量，兩者混勻離心后分裝20μl至單個PCR反應(yīng)管)。

擴(kuò)增試劑加好后將所有PCR反應(yīng)管于5,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本核酸提取物、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品各5μl，蓋緊管蓋，于5,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。

 4. PCR擴(kuò)增（檢測區(qū)）

         94℃ 3min；

         94℃ 30s

         55℃ 30s

         72℃ 30s

         72℃ 7min；

         4℃  Hold；

         設(shè)置25μl體系。

5. 電泳檢測（電泳區(qū)）

稱4g瓊脂糖放于500ml錐形瓶中，加入200ml 1×TAE電泳緩沖液，于微波爐中熔解，室溫冷卻10min后加入10μl核酸染料混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10~20μl，加入終濃度1×的上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，100~120V電壓在1×TAE電泳緩沖液中電泳至溴酚藍(lán)處于凝膠1/2處（約30min），紫外燈下觀察結(jié)果。

    【結(jié)果判斷】

陽性對照出現(xiàn)320bp擴(kuò)增帶、陰性對照無該位置的特異條帶出現(xiàn)（引物帶除外），實驗結(jié)果成立，否則視為無效。被檢樣品出現(xiàn)320bp擴(kuò)增帶為單核細(xì)胞增生李斯特菌陽性，否則為陰性。

【注意事項】

1． 有關(guān)實驗室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2． 實驗請嚴(yán)格分區(qū)操作：流程順序為配液區(qū)→樣本提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。

3． 試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。

4． 在-20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。

5． 核酸染料低毒，應(yīng)于室溫條件避光保存，操作時應(yīng)戴上手套，染料和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。

6． 嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最H的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

7． 反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在3次內(nèi)用完，請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

【儲存條件及有效期】

-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。

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